J Neurosci︱美国NIH席正雄团队发现大麻非成瘾效应的新机制

撰文︱梁  盈, 韩  笑

责编︱王思珍，方以一

编辑︱王思珍

随着大麻合法化在全球热议，其神经生物学效应越来越受到关注。人类对于大麻类物质的应用历史可以追溯到公元前2000年，在印度古籍中就有关于大麻类物质的医疗以及娱乐用途记载。大麻中含量最多的生物活性物质为四氢大麻酚（Δ9-THC），也就是人们常说的精神刺激物的主要成分。然而大麻或者Δ9-THC是否具有成瘾性一直备受争议。很长时间以来，人们一直认为大麻的中枢兴奋或者成瘾效应主要是通过作用于中脑腹侧被盖区（VTA）GABA神经元上的I型大麻素受体（CB1Rs），从而解抑制多巴胺（DA）神经元，激活脑内多巴胺神经通路[1]。然而，支持这一观点的行为学证据非常匮乏。与之相反，美国药物依赖研究所（National Institute on Drug Abuse，NIDA）席正雄团队及其他研究人员发现大麻素在多种实验动物模型并不产生中枢兴奋或者成瘾效应[2-5]。相反多种大麻素如Δ9-THC在实验大鼠和小鼠主要产生厌恶（即降低多巴胺神经元活动及其对奖赏刺激的兴奋反应）、抗焦虑和抑制运动行为[5-6]。但其作用机制仍知之甚少。

2022年12月，美国药物依赖研究所席正雄研究员带领的团队在《神经科学杂志》（The Journal of Neuroscience）发表了题为“Cannabinoid CB1 Receptors Are Expressed in a Subset of Dopamine Neurons and Underlie Cannabinoid-Induced Aversion, Hypoactivity, and Anxiolytic Effects in Mice”的研究论文，发现中脑多巴胺神经元上表达CB1受体[7]。该多巴胺神经元主要位于VTA内侧靠近中脑中线的部位，可同时释放多巴胺和谷氨酸。进一步的功能活动分析发现兴奋该神经元上的CB1受体介导了大麻素产生的厌恶，抗焦虑，和运动抑制效应。来自中国军事医学研究院的韩笑副教授和中南林业科技大学的梁盈教授为本文的并列第一作者，席正雄为本文通讯作者。（拓展阅读：席正雄课题组相关研究进展，详见“逻辑神经科学”报道（点击阅读）：Sci Adv︱席正雄团队发现运动奖赏新机制：中脑红核-腹侧被盖区谷氨酸神经通路）

在这篇文章中，作者首先应用RNAscope原位杂交技术检测了脑内CB1受体基因（mRNA）。发现CB1 mRNA 在中脑VTA的前后区域几乎检测不到（图1A和C），但在位于VTA的中间部份检测到了高密度的CB1-TH 共表达的多巴胺神经元（图1B）。

图1：前、中、后VTA 区域TH和CB1 mRNA 的表达。 红色细胞为酪胺酸羟化酶(TH)阳性的多巴胺神经元， 绿色为CB1 mRNA

（图源：Han X, et al., J Neurosci, 2022 ）

然后作者检测了从外侧VTA到内侧VTA表达CB1受体的多巴胺神经元的空间分布（图2）。发现CB1受体阳性的多巴胺神经元呈现“向心性”的分布，即靠近VTA中间和中线的CB1-TH共表达的多巴胺神经元密度最高，而往外侧VTA方向 CB1-TH共表达的神经元数量则越来越少（图3）。    

图2：代表性的TH和CB1 RNAscope图像。箭头指示TH和CB1 mRNA共表达的多巴胺神经元

（图源：Han X, et al., J Neurosci, 2022 ）

图3：表达CB1受体的多巴胺神经元在中脑VTA前部(A), 中部(B),和后部(C)的空间分布

（图源：Han X, et al., J Neurosci, 2022 ）

为了确认CB1受体 mRNA信号的特异性，作者应用了基因剪接技术敲除了多巴胺神经上的CB1受体（即DA-CB1-KO小鼠）作为阴性对照。发现CB1和TH 共表达只存在于DAT-Cre小鼠（图4A），而在DA-CB1-KO小鼠脑内检测不到CB1-TH共表达的多巴胺神经元（图4 B）。值得注意的是，在其他非多巴胺神经元中仍可检测到CB1 mRNA信号，表明DA-CB1-KO小鼠多巴胺神经元中CB1R选择性缺失（图4B）。

图4：在DAT-Cre小鼠的多巴胺神经元检测到TH和CB1 mRNA的共定位(用白色箭头标记)(A)，但在DA-CB1-KO小鼠中则没有检测到(B)

（图源：Han X, et al., J Neurosci, 2022 ）

由于高密度的谷氨酸神经元也位在于靠近中线VTA部位，所以作者进一步研究了表达CB1受体的神经元是否为谷氨酸能神经元或者多巴胺-谷氨酸双重神经元。作者首先检查了CB1-TH或CB1-VgluT2（大脑皮层下区域的谷氨酸能神经元标记物）在该区域的共定位。发现大多数CB1受体阳性的神经元为TH阳性的多巴胺能神经元（图5A）或者VgluT2阳性的谷氨酸能神经元（图5B）。

图5： VTA中部RNAscope图像，显示CB1-TH mRNA在多巴胺能神经元的共定位(A)和CB1-VgluT2在谷氨酸能神经元的共定位 (B)

（图源：Han X, et al., J Neurosci, 2022 ）

然后，作者使用三重标记RNAscope 原位杂交技术检测CB1-TH-VgluT2的共表达，发现该脑区大部分多巴胺神经元（>90%）显示TH-CB1-VgluT2共定位（图6）。此外，在其它不表达TH的谷氨酸神经元中也检测到CB1受体信号（图6），说明CB1受体不仅在多巴胺-谷氨酸能双重神经元中有表达，而在其他谷氨酸能神经元中也有表达。

图6：三重标记RNAscope 原位杂交技术检测到CB1-TH-VgluT2的共表达，提示表达CB1受体的神经元多为多巴胺-谷氨酸能双重神经元 

（图源：Han X, et al., J Neurosci, 2022 ）

进一步研究多巴胺神经元上CB1受体的功能，作者应用光遗传学技术建立了一个新的脑内光刺激自我奖励模型（optical intracranial self-stimulation，oICSS）（图7 A-B）[8]。发现选择性地兴奋位于VTA内侧的多巴胺神经元可维持高频率的自我刺激奖励行为（图7 C-D）。该行为可以被多巴胺D1或者D2受体抑制剂所阻断（图7 E-F），证实其为多巴胺依赖性的脑刺激奖励行为。给与高成瘾性物质如中枢神经兴奋剂可卡因则增强该自我刺激奖励行为，上移oICSS刺激-反应曲线（图7 G-H）。

图7：多巴胺依赖性的oICSS脑刺激奖励行为

（图源：Han X, et al., J Neurosci, 2022 ）

与之相反，大麻素Δ9-THC和ACEA（CB1受体激动剂）在DAT-cre对照组小鼠则剂量依赖性地抑制oICSS脑刺激奖励行为，使得oICSS刺激-反应曲线显著下移（图8）， 提示两种大麻素产生了奖励抑制，或者说对大麻素的厌恶效应。而这一作用在DA-CB1-KO小鼠中明显减弱或者消失，说明多巴胺能神经元上的CB1受体介导了Δ9-THC和ACEA的厌恶效应。

图8：大麻素（Δ9-THC和ACEA）抑制光刺激奖励行为（oICSS） 

（图源：Han X, et al., J Neurosci, 2022 ）

然后作者应用脑内微透析方法获取脑内细胞外液样本以检测 不同剂量Δ9-THC对脑内多巴胺（DA）含量的影响。发现在DAT-cre小鼠 高剂量的Δ9-THC 显著降低伏隔核（NAc）中DA的含量，而在DA-CB1-KO小鼠，NAc中的DA含量不受Δ9-THC的影响，说明多巴胺神经元上的CB1受体介导了Δ9-THC的DA效应（图9）。 此外，在多巴胺神经元上敲除了CB1的小鼠，细胞外基础DA含量也明显高于DAT-cre小鼠，说明多巴胺神经元上的CB1在生理状态下对于DA的释放有着抑制作用。

图9：Δ-THC对DAT-Cre和DA-CB1-KO小鼠伏隔核细胞外DA含量的影响

（图源：Han X, et al., J Neurosci, 2022 ）

最后作者应用运动活动和高空位置偏爱（EPM）行为模型进一步评价了多巴胺神经元上CB1受体的作用。发现Δ9-THC显著降低DAT-cre小鼠的自发运动活动，并显著延长其在高空开放（无护栏）平台上停留的时间（图10）。后一发现说明Δ9-THC产生了明显的抗焦虑的作用。然而，Δ9-THC产生的这两种行为学效应在DA-CB1-KO小鼠中完全消失（图10），说明多巴胺神经元上的CB1受体参与大麻素产生的这两种中枢效应的调节。

图10：Δ9-THC对小鼠运动活动和焦虑样行为的影响

（图源：Han X, et al., J Neurosci, 2022 ）

文章结论与讨论，启发与展望

综上所述，这篇文章首次报道了多巴胺神经元上有功能 性的 CB1受体表达。激活该受体介导了大麻素或者大麻样物质产生的一系列中枢神经效应如抑制大脑对奖励刺激的反应（即厌恶效应）、抗焦虑、以及抑制运动行为。由于CB1受体在多种神经元有表达，兴奋GABA神经元的CB1受体产生奖励，而兴奋谷氨酸神经元的CB1受体也产生厌恶效应[2]，所以大麻素所产生的最终精神效应将取决于不同种类神经元上CB1受体激活后所产生的综和效应 - 可能是欣快，没有作用，或者令人不快的厌恶反应[6]。不同个体对大麻素的反应取决于其受体的细胞学分布。这一发现，对于几十年来一直存在的大麻类物质是否具有成瘾性的争议提供了坚实的实验证据和全新的理论依据。同时对于研发大麻类物质在临床医学上的运用也提供了全新的视角，具有重要的价值。

原文链接：https://doi.org/10.1523/jneurosci.1493-22.2022

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参考文献（上下滑动查看）  

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本文完